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　　1　引　　言

　　自60年代Clark發明葡萄糖氧化酶(GOD)——過氧化氫產物的酶電極、80年代證實皮下組織(S.C.)液的葡萄糖(G.S.)濃度與血的一致以來〔1〕，利用酶電極并從S.C.采樣以動態監測血糖的研究正在走向實用階段。本文將所構建的新的脈沖式微透析法葡萄糖傳感器系統及其體外特性、抗干擾能力和溫度特性的研究報道于下。

　　2　檢測原理和實驗方法

　　2.1　檢測原理

　　脈沖式微透析法葡萄糖傳感器系統的檢測原理參見圖1。

 
圖1　脈沖式微透析葡萄糖傳感器系統的檢測原理

　　圖中的脈沖式微泵內裝有CPU，可按需定時定量泵出液體。本研究中每20分鐘泵磷酸緩沖液(pH7.4)20μl至微透析探針的導管內。導管外層為微透析膜。導管內外液體中的各物質依據各自的濃度梯度在20分鐘內從高濃度向低濃度擴散。在體內，探針置于S.C.,故S.C.中的G.S.將向緩沖液中擴散。在本研究中，探針置于不同濃度的G.S.中。其后，含G.S.的緩沖液經管道系統泵入流動室。流動室以白金為陽極，電壓+700mv,Ag/Agcl為陰極。室外是改良的YSI酶膜，其上固定著GOD和過氧化氫酶。在酶膜和電極之間是一層Teflon膜，以濾過大分子干擾物。G.S.在流動室的反應如下〔2〕：

　　
　　與流動室相連的電流計將此反應電流放大、輸出。電流的大小與G.S.濃度成正比，其值由曲線記錄儀記圖如圖2。

　　2　脈沖式微透析法葡萄糖傳感器輸出信號

　　脈沖式微泵、流動室、微透析探針、殘液回收器由德國Eppendorf公司協同研制、提供；Biometra Ep 30電流計、BD101雙筆式曲線記錄儀、循環加熱器、溫度監測儀均由德國呂貝克醫科大學Kerner教授實驗室提供；酶膜及Teflon膜分別來自Yellow Spring器械公司和Universal Sensor ZNC；各種實驗用化學品來自Sigma化學公司。

　　2.2　實驗方法

　　2.2.1　葡萄糖恢復的檢測

　　按圖1連接脈沖式微泵和微透析探針、管道，其末端接一微管。將探針分別放入盛有5.5mM和10mM G.S.的燒杯中。每20分鐘在微管和燒杯中同時分別采等量樣本一次。每對樣本均在Backman葡萄糖檢測機上測定濃度。實驗在此兩種濃度的G.S.中各進行5次。

　　2.2.2　改良的YSI酶膜的制作

　　2.0%過氧化氫(Sigma (9284)20μl加入100μl的2.5%戊二FEB6液中，混勻，取60μl均勻滴于YSI膜的正面，37℃恒溫器上干燥12小時。

　　2.2.3　輸出電流與G.S.濃度間相關性實驗

　　按圖1連接整個系統。把微泵、流動室、探針及裝有不同濃度G.S.的燒杯放入一密閉的金屬箱，此箱與循環加熱器相連，保持溫度于37℃。分別在0和10mM G.S.中運行此系統30小時，所得基線穩定，則以2.5，5，10，20mM G.S.濃度為梯度進行漸增漸減實驗，每一濃度試驗1小時20分，從2.5～20mM G.S.為一個循環，共行12個循環。

　　2.2.4　抗干擾試驗

　　在37℃讓整個系統于0和10mM G.S.中分別工作12和30小時，性能穩定則從0.05，0.1，0.2，0.3mM的抗壞血酸或醋氨酚液(均不含G.S.)為梯度進行試驗。每一濃度試驗1小時20分。兩種干擾物各試驗3次。

　　2.2.5　溫度實驗

　　用溫度監測儀監測金屬箱內的溫度。從20逐步上升至40℃，再漸降至20℃，每5℃為一梯度，每一溫度保持1小時，同一系統分別在0和10mM G.S.中各進行一次則為一個溫度實驗循環。本研究共進行了3個循環。

　　各實驗結果均用Sigma Plot 軟件進行統計。

　　3　實　驗　結　果

　　在5.5和10mM G.S.杯中各取5份標本及配對的經微透析采樣的標本各5份，同在Backman機上測定、配對計算及統計分析，結果顯示本系統微透析探針的葡萄糖恢復為97±2.2%，遠高于Y.Hashigrouchi 35.6±0.2%的報道。〔3〕

　　圖3顯示0至20mM G.S.中，G.S.濃度與電極輸出電流間均呈線性關系，其相關系數均值達0.986。

 
圖3　傳感器電流與葡萄糖濃度的相關性

　　本系統的體外特性如表1。背景電流較其他文獻報告更低〔4〕，與Y.Haslugrocli等的相同〔3〕，均是至今報告中最低的。30小時的漂移值未見報道。5.5mM G.S.中測試24小時所得最低漂移值為0.255%-1mM-1h〔5〕，本研究10mMG.S.中測試30小時的漂移值為0.103%-1mM-1h。由于G.S.濃度越高，傳感器運行時間越長，其漂移程度越明顯，所以本組的結果是迄今為止報告的最低值，且意義更大。

　　表2的抗干擾結果顯示：0.1mM的抗壞血酸與電極輸出電流無相關性。較高濃度的抗壞血酸和各濃度的醋氨酚液均只引起微小的干擾電流。

　　從圖4、5中可見在雙蒸水中，傳感器輸出電流隨溫度升高而增加，此種現象在10mMG.S.時更明顯，但同一溫度值時輸出電流值較接近。

　　　　
 
圖4　0mMG.S.中溫度實驗 　　　　　　　　圖5　10mM G.S.中溫度實驗

　　三次10mMG.S.溫度實驗中的溫度系數分別為3.63%、2.96%、3.63%。其計算公式如下：

　　式中：Itmax、Itmin和It35℃分別為最高溫度、最低溫度和35℃時的穩態電流值；tmax、tmin為最高和最低溫度。

　　4　討　　論

　　20多年來許多專家致力于持續監測血糖的研究，但存在以下問題：一、微透析膜兩側物質擴散不充分，使葡萄糖的恢復不完全。半透膜的物質擴散與兩側的物質濃度梯度和持續時間有關。二、上述不完全性影響了測量的準確性，因而需用體內兩點法來校正〔6〕。即在病人身上人為地造成高、低血糖狀態。這對危重病人來講是十分危險的，并需較長的檢測前校正時間而不具及時性。三、持續監測時血糖濃度信號連續變化不斷，難免前后信號互相干擾，影響檢測的準確性和可信性。最后，持續監測血糖需攜帶較多的緩沖液，不利于小型化。我們從實際需要考慮，提出間歇監測血糖的新思路，采用脈沖式微泵，使前后電信號相隔20分鐘發出。圖2已示本傳感器電流20分內已穩定于基線，達到避免前后電信號互相干擾的目的。改良的YSI膜在這方面也有貢獻。當只存在GOD時，電極陽極端汲出電子的過程相對緩慢，故峰電流回基線需數十分鐘，其間第二個峰電流已發出，因前者未達基線，故從較高水平開始上揚，出現干擾。改良的YSI膜中加了過氧化氫酶，加快了電子汲出過程，使在瞬間產生快速上揚和下降的峰電流并很快達基線。這一結果使電極輸出電流與G.S.濃度間的直線相關性更好、更可信。未采用改良的YSI膜時，系統的背景電流為0.7±0.2nA，電極輸出電流與G.S.濃度間的直線相關系數為0.92〔4〕，此事實也支持上述分析。脈沖式微泵24小時泵液1.44ml，回收的殘液更少，使傳感器系統更小；與微透析技術結合應用，幾乎達到葡萄糖完全恢復，故不需體內校正，更安全、方便和及時。從臨床來講也無須每分每秒監測血糖，因血糖的較大波動、藥物作用的發揮都需一定的時間。

　　在體外實驗中，影響電流漂移最主要的因素是傳感器的結構和傳導層。理想的漂移結果提示本傳感器結構合理及改良酶膜的重要。因為GOD固定于膜及第二種酶(如過氧化氫酶)的使用可改善傳感器的穩定性是眾所周知的〔2〕。

　　雖然GOD對β-D-G.S.是非常特異的，但這種特異性被電極的不良選擇性所減低。在適當的電壓范圍內，電極能氧化所有存在于液體中的可氧化物質。因而必須限制干擾物進入傳感器。血液和組織液中的許多生化物質和藥物，如抗壞血酸和醋氨酚，或通過電極的氧化，或通過與G.S.產生的過氧化氫發生反應而干擾傳感器的功能〔8〕。本系統采用了Teflon膜及改良的YSI膜，對上述干擾物的各個干擾環節均能發揮限止作用。尤其是改良的YSI膜能在瞬間分解過氧化氫，因而在減少過氧化氫與干擾物起反應的機會中具有重要意義。人體血液抗壞血酸的正常范圍是23～85μl〔9〕；服藥者血液中醋氨酚為13～40μl。本組抗干擾實驗所用的濃度均超過上述值數倍至數百倍，但其最大干擾電流也小于10mMG.S.電流的4%，可以忽略不計，證實本系統具有較強的抗干擾能力。

　　葡萄糖傳感器輸出電流隨溫度的升高而增大是酶電極傳感器的特性。這種特性干擾了傳感器對發熱病人血糖監測的準確性，限止了它的臨床應用。本研究所得的溫度實驗結果顯示其在20至40℃雙蒸水中，輸出電流最大變化也小于4nA，無干擾意義。同一溫度時電極輸出電流有些差異，主要由金屬箱溫度傳遞差異和G.S.在溫度增高時水份蒸發所致，故不影響實用。在G.S.中由于酶在接近最佳功能溫度時(GOD與過氧化氫酶為37℃)活性明顯增加，所以存在干擾電流。據此，我們以溫度——輸出電流呈直線關系為假設，以35℃為基本條件(正常人S.C.溫度多在35℃左右)，計算得溫度系數為3.4%左右(10mMG.S.中)，即溫度每升高1℃，輸出電流增加3.4%。盡管從圖4、5中知道溫度—輸出電流間并非直線關系，但知道溫度系數的大致范圍后可采用各種方法(如曲線補償法、計算機程序補償法等)補償兩者間的大部分偏差。加之體溫高于40℃時，S.C.仍很少超過40℃，故實際的溫度變化更小。另外，高熱時糖尿病者往往有嚴重并發癥，后者使血糖大幅度增加，相比之下，經大部分校正后的溫度所引起的輸出電流的增加就顯得不重要了。因此，本系統在發熱患者中確有應用價值。

　　5　結　　論

　　我們在此介紹的葡萄糖傳感器系統具有體積小，校正簡便、安全、及時，傳感器性質穩定、檢測精度高和抗干擾能力強的特點，同時也有較理想的溫度特性。此系統攜帶方便、應用范圍廣、操作簡便安全，更符合臨床實際需求。